"Mit der Absicht, die askanische Landesherrschaft durch eine zuverlässige geistliche Verwaltungseinrichtung zu festigen, gründeten Graf Heinrich von Gardelegen (Regierungszeit 1184-1192) und der regierende Markgraf Otto II (1184-1205) das Kollegiatsstift St. Nikolaus und richteten dort Stellen für 12 Säkularkanoniker und einen Propst ein.

Bei Papst Clemens erwirkte man für das neue Stift die Exemtion (Ausgliederung) aus der Abhängigkeit und Gerichtsbarkeit des Diözesanbischofs in Halberstadt und erlangte zugleich den unmittelbaren apostolischen Schutz.

Obgleich niemals für einen Bischofssitz vorgesehen, erlangte St. Nikolai umgangssprachlich alsbald den Status eines Domes.
Als Patron von Stift und Kirche wählte man den in Norddeutschland sehr beliebten Kaufmannsheiligen Bischof Nikolaus von Myra und erwarb eigens eine Ampulle "Niklasöl" aus Bari in Süditalien.

Die Stiftsherren, die dem altmärkischen Adel und Stendaler Patrizierfamilien entstammten und häufig studierte Juristen waren, übten im Stendaler Domstift neben ihren geistlichen Pflichten, zu denen die Chorgebete (Stundengebete) und Memoraliendienste gehörten, ihre Verwaltungsaufgaben aus.
In ihren gottesdienstlichen Pflichten ließen sie sich durch Vikare mit Priesterweihe, die im Stift lebten, vertreten.

Nach der Reformation wurde ab 1540 eine Neubesetzung der damals 14 Kanonikerstellen und 35 Vikarien nicht mehr genehmigt.
Endgültig aufgelöst wurde das Stiftskapitel 1551.

Martin Luther entsendete 1539 seinen Freund und Mitstreiter Konrad Cordatus als ersten Superintendenten der Altmark und Prignitz an den Dom nach Stendal, um von dort die Reformation in der Mark Brandenburg voranzutreiben.

Als Predigtkirche des (General)supterintendenten blieb der Dom die wichtigste Kirche der Altmark.